纳米抗体疗法挽救NMDA受体功能低下引起的神经行为缺陷

脑部疾病（如精神疾病和神经退行性疾病）对个人、家庭和社会都带来了严重的负担。这些疾病不仅影响患者的认知功能、行为能力和日常生活质量，还可能导致患者失去自理能力，增加家庭成员的照顾压力，甚至造成生命危险。此外，由于治疗和护理成本高昂，这些疾病也给社会医疗系统带来了巨大经济负担。

现如今，脑部疾病的治疗手段日趋多样化，包括综合药物治疗、基因治疗、干细胞治疗以及免疫疗法等。然而，目前的大多数治疗方法仍主要以缓解症状为主，难以实现对疾病的根治或有效阻止神经元的持续损伤。迄今为止，针对这些疾病的治疗主要依赖于小分子药物的研发和应用，但这类药物有时缺乏靶向特异性，容易出现脱靶效应，从而引发不良副作用。相比之下，抗体药物因其对靶标的高度特异性而备受关注，但免疫球蛋白（IgG）穿透血脑屏障的能力十分有限，限制了其在脑部疾病治疗中的应用。此外，抗体治疗还面临诸多挑战，如肿瘤微环境的免疫抑制作用、潜在的免疫排斥反应，以及特异性靶点的缺乏等问题，这些都成为制约脑部疾病免疫治疗效果的重要因素。

近几年，纳米抗体（VHH）在阿尔茨海默病的诊断和治疗领域显示出巨大潜力，特别是在生物标志物的检测、影像诊断的早期检测以及治疗分子的靶向传递方面，抗体治疗有望成为脑部靶向干预的一种可行路径。为探索纳米抗体是否能穿越血脑屏障并改善与NMDA受体功能低下相关的认知和行为缺陷。法国法国蒙彼利埃国家科学研究中心、蒙彼利埃大学Philippe Rondard领导的国际科研团队发表在Nature上的发表的题为：“Nanobody therapy rescues behavioural deficits of NMDA receptor hypofunction”的研究，提出了一种基于纳米抗体的治疗方法，用于治疗与NMDA受体功能低下相关的脑部疾病。

报道中研究人员开发了一种双特异性二价抗体，由两个纳米抗体组成，一个结合同源二聚体代谢型谷氨酸受体2（mGluR2），另一个增强mGluR2的活性。实验结果证明了这种二价纳米抗体通过外周给药可到达大脑，并在两个前临床小鼠模型中纠正认知缺陷，这两个模型的表型源于NMDA受体功能低下。值得注意的是，这些体内效应在单次腹腔注射后至少持续7天，并且在亚慢性治疗后仍维持。研究确立了纳米抗体可以靶向大脑受体的概念，为基于纳米抗体的脑部疾病治疗策略铺平了道路。

研究人员早期已报道了关于DN13——一种作为正向变构调节剂（PAM）的纳米抗体，其特异性靶向代谢型谷氨酸2（mGlu2）受体同源二聚体。mGlu2受体被认为是减少与精神分裂症相关脑区谷氨酸能张力的关键靶点。事实上，已有多种针对mGlu2的候选药物在精神分裂症治疗的II期临床试验中进行了评估。然而，由于对mGlu3受体的交叉作用以及在接受抗精神病药物治疗的患者中mGlu2表达水平下降等因素，这些药物在III期试验中未能取得成功。DN13的独特之处在于其仅结合mGlu2同源二聚体的大胞外域在激动剂结合状态下的构象，且不与其他mGlu受体发生交叉反应。此外，DN13的PAM特性已在脑切片实验及通过直接脑内注射的恐惧条件反射模型中得到验证。因此，DN13是评估纳米抗体是否可用于缓解与脑部疾病相关症状以及外周给药是否能引发中枢神经系统效应的理想候选分子。在此基础上，研究人员进一步优化了纳米抗体以增强其对mGlu2受体的活性，并建立了其有效穿透血脑屏障的概念验证模型。

实验重点：

二价纳米抗体增强mGlu2受体活性

为了在较低浓度下实现大脑中的药理作用，通过提高纳米抗体DN13对mGlu2受体的亲和力来优化其性能。具体策略是将DN13与mGlu2选择性中性纳米抗体DN1或激动剂-PAM纳米抗体DN10融合，生成并筛选一系列二价纳米抗体，以提升结合强度或停留时间。最终优选出双特异性二价纳米抗体DN13–DN1（图4a），其在激动剂LY379268存在下对mGlu2的表观亲和力（Kd）比DN13单独作用时提高了十倍（分别为0.50 nM和4.10 nM）（图4c）。此外，DN13–DN1的PAM效力（EC50）较DN13提高了近两个数量级（分别为1.76 nM和101 nM）（图4d），并且对mGlu2具有高度特异性，不与其他mGlu受体交叉反应。通过荧光标记的DN13–DN1进行脑组织免疫组化分析，进一步验证了其选择性结合，结果显示在mGlu2高表达脑区如前额叶皮层、海马、纹状体等部位有明显信号，而在mGlu2敲除小鼠中则无信号（图4e）。综上，DN13–DN1在提升mGlu2靶向性和药效方面展现出显著优势。

进一步评估了DN13–DN1通过腹腔注射（i.p.）给药的药代动力学特性及其在脑内的分布，验证DN13–DN1是否可穿透进入脑组织。结果表明，DN13–DN1较DN13清除更慢，在血液中可维持约8小时。部分DN13–DN1进入大脑，在4小时后达到最大浓度（9.2 nM，约为Kd的20倍），并在脑内持续存在达7天。免疫组化和放射自显影结果显示，其分布在多个脑区（如腹侧被盖区和大脑皮层），且在mGlu2受体表达区域富集，提示其可有效激活mGlu2受体，并具有持久性和局部富集的特点（图4f、g）。

DN13-DN1恢复工作记忆和感觉门控

为验证DN13–DN1在另一种NMDA受体功能低下模型中的行为效应，本研究采用了GluN1敲低（GluN1-KD）遗传性小鼠模型。该模型模拟了罕见的人类遗传疾病GRIN1，其特征在于Grin1基因发生低功能性突变，导致大脑中含GluN1的NMDA受体数量减少，从而引起部分功能缺失。GluN1-KD小鼠的行为特征与低剂量NMDA受体拮抗剂处理的小鼠相似。

首先，在评估短期工作记忆的Y迷宫行为测试中，GluN1-KD小鼠表现出显著的认知功能损伤（图5a, b）。值得注意的是，单次腹腔注射DN13–DN1（20 mg/kg）在注射后3小时显著改善了其工作记忆，效果与LY379268（1 mg/kg）在测试前1小时注射的效果相当。且这种改善并非由于药物或纳米抗体引发的过度活动所致。作为对照，DN13–DN1和LY379268在相同条件下对野生型（WT）小鼠均无影响（图5b）。令人惊喜的是，单次给药7天后，DN13–DN1仍然能够显著改善GluN1-KD小鼠的工作记忆，而LY379268的改善效果则在7天后消失（图5c）。这一结果表明，DN13–DN1具有长期改善认知缺陷的能力，这可能与其能够在大脑中长时间停留并持续激活mGlu2受体有关。

此外，GluN1-KD小鼠还表现出感觉处理障碍。通过声学惊跳反应的前脉冲抑制（PPI）实验，发现其感觉运动门控功能受损（图5d–f）。单次注射DN13–DN1（20 mg/kg）在3小时后显著改善了PPI，特别是在81 dB的前脉冲强度下（。更值得注意的是，在未再次给药的情况下，7天后重新测试发现DN13–DN1仍能有效改善PPI，且在69 dB和81 dB两个强度下效果均增强，而LY379268在7天后不再显示出改善作用。这表明DN13–DN1具有更持久的行为效应（图5e）。进一步研究显示，DN13–DN1治疗并未改变mGlu2受体在大脑不同区域的表达水平，且其行为效应与动物的性别或体重无关。

综上所述，双价纳米抗体DN13–DN1在单次腹腔注射后，不仅显著改善了GluN1-KD小鼠的认知缺陷和感觉运动门控障碍，而且其效果可持续至少7天，展现出比传统小分子药物更持久的治疗潜力。这一发现为开发长效治疗NMDA受体功能低下相关疾病（如精神分裂症或某些神经发育障碍）提供了新的策略和希望。

研究意义与结论

这篇研究开发了一种靶向mGlu2受体的双价纳米抗体DN13–DN1，证明其可通过外周注射进入大脑，长期改善NMDA受体功能低下模型小鼠的认知和感觉门控缺陷，为脑部疾病治疗开辟了新的免疫疗法路径。

迄今为止，纳米抗体疗法已经在多个医学领域展现出广泛的应用前景。除了在肿瘤治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病、诊断工具、神经系统疾病和心血管疾病中的应用外，纳米抗体还在器官移植排斥反应的预防、代谢性疾病（如糖尿病）的治疗以及靶向药物递送系统中显示出潜力。随着研究的不断深入和技术的持续进步，纳米抗体疗法正朝着更高效、更精准的方向发展，为现代医学提供了全新的治疗策略和希望。

纳米抗体优势

纳米抗体是骆驼科动物体内重链抗体的可变VHH结构域，作为免疫系统中衍生出的最小抗体片段，其分子量仅为约15kDa，由三个互补决定区（CDRs）组成。这些特性使其能够高效地结合靶蛋白中的小空腔，并稳定特定的构象，从而有效调节靶标活性。由于其体积小、穿透性强，纳米抗体被视为靶向脑部疾病的一种有潜力的替代治疗方式。

百英羊驼纳米抗体开发